طی یک دهۀ اخیر پیشرفت‌های فراوانی با ظهور تکنیک توالییابی نسل جدید (Next Generation Sequencing) یا NGS در توالییابی ژن‌ها و تشخیص بیماری‌های ژنتیکی صورت گرفته است. با استفاده از تکنیک NGS تشخیص علل ژنتیکی تعداد زیادی از بیماری ها و سندروم ها مثل ناهنجاری های مادرزادی که پیش از این به دلیل محدودیت‌های تکنیک‌های مورد استفاده به عنوان "با علل نامعلوم "بیان می‌شد، مشخص گردیده است. روش NGS در واقع متشکل از روش‌های آماده سازی اولیه و برش ژنوم مورد مطالعه، توالییابی آن، تصویربرداری و مرئی سازی، سرهم نمودن قطعات توالی یابی شده و آنالیز تمامی این داده‌ها می‌باشد. از کاربردهای NGS میتوان به بهبود تشخیص بیماری های ژنتیکی، PGD، اپی ژنتیک و فارماکوژنومیکس (پیش بینی ژنتیکی اثرات داروها در بدن) اشاره کرد. موارد زیر مثال هایی از اختلالاتی می‌باشند که با استفاده از تکنیک NGS و با بررسی تعدادی از ژن‌ها و یا کل ژنوم مورد بررسی قرار می گیرند :
سرطان‌های ارثی، بیماری‌های ژنتیکی قلب (مانند آریتمی‌ها)، بیماری ژنتیکی پوست (مثل ژنودرماتوزها)، بیماری‌های سیستم اسکلتی و استخوانی، ناتوانی‌های ذهنی و تأخیر تکاملی، ناشنوایی‌ها و نابینایی‌های ارثی، معلولیت‌های حرکتی، بیماری‌های سیستم اعصاب مرکزی، بیماری های متابولیک ارثی (مانند فنیل کتونوری و گالاکتوزمیا)، بررسی های ژنتیکی PGD، اختلالات نقص ایمنی، بیماری های خونی و اختلالات انعقادی، اختلالات ژنتیکی دستگاه تولید مثل و دلایل ناباروری، بیماری‌های ژنتیکی عملکرد و ساختار کلیه‌ها، بیماری های ژنتیکی دستگاه تنفسی و گوارشی، بیماری های ژنتیکی غدد درون ریز و ...
توالی یابی کل اگزوم (WES)
تمامی اگزون‌های ژنوم را در مجموع "اگزوم" می‌گویند و به توالی یابی آن‌ها، توالی یابی کل اگزوم یا WES می‌گویند. در این تکنیک به‌جای توالییابی تعداد محدودی از ژن‌ها، امکان شناسایی تغییرات و تنوعات ژنتیکی در همۀ نواحی کدکننده‌ی پروتئین فراهم میشود. به دلیل اینکه اکثر جهش‌های شناخته‌شده ای که بیماری‌زا هستند در اگزون‌ها اتفاق می‌افتند، توالی یابی کل اگزوم روشی بسیار کارآمد جهت شناسایی جهش‌های بیماری‌زا می‌باشد.
تکنیک WES در تشخیص های بالینی بسیار ارزشمند می‌باشد و دید بهتری از چینش ژنتیکی بیماری را ارائه می‌دهد. اگزون‌ها تنها ۲ درصد از کل محتوای ژنوم را در بر دارند، با این وجود نزدیک به ۸۵ درصد از جهش‌های DNA که باعث بسیاری از اختلالات ژنتیکی در انسان هستند را شامل می‌گردد. در واقع تعیین توالي اگزومی در تحقیقات ژنتیک پزشکی، نقش بیشتر از هزاران ژن را در اختلالات مندلی مشخص نموده و این آمار با سرعت در حال رشد می‌باشد.
توالی یابی کل ژنوم (WGS)
تحقیقات اخیر مشخص نموده که تغییرات DNA در خارج از نواحی اگزونی هم فعالیت ژن و تولید پروتئین‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد و قادر به ایجاد ناهنجاری‌های ژنتیکی در فرد می‌شوند که تکنیک WES قادر به پیدا نمودن این تغییرات در این نواحی نمی‌باشد. جهت رفع این مشکل روش دیگری به نام توالییابی کل ژنوم یا WGS ایجاد گردید که در آن ترتیب همه‌ی نوکلئوتید‌های DNA فرد مشخص می‌گردد و قادر به تشخیص تغییرات در هر قسمتی از ژنوم خواهد بود.
در این تکنیک کل توالی ژنومی شامل ژنوم هسته ای و همچنین DNA میتوکندریایی در سلول‌ها (در گیاهان DNA کلروپلاست را نیز شامل می‌گردد) توالی یابی می‌شوند. حدود هزاران ژن فعال و هزاران توالی خاموش، همزمان بررسی و ارزیابی می‌شوند. تکنیک WGS با پوشش 5/98 درصدی توالی های کد کننده، از کارآمدترین روش‌ها جهت شناسایی جهش‌های ژنتیکی می‌باشد.
این دو روش WGS و WES به طور گسترده در تحقیقات و پزشکی بالینی جهت شناسایی تغییرات ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرند. این دو روش اکنون با نام توالی یابی نسل جدید (NGS) هم شناخته شده هستند.
کاربردهای توالی یابی نسل جدید (NGS)
تکنیک NGS را علاوه بر انسان میتوان برای هر ارگانیسمی از جمله باکتری ها، حیوانات و گیاهان و غیره به کار برد. در زیر تعدادی از کاربردهای مهم NGS در زمینه های مختلف ذکر شده است.
کاربرد NGS در شناسایی جهش های مربوط به اختلالات ژنتیکی
تکنیک NGS قادر به توالی یابی ژن‌های بزرگ و کوچک بیمارهای ژنتیکی است و کل نواحی اگزونی و همچنین توالی های همراه با آن را در بر می‌گیرد. پوشش دهی گستردۀ این چنینی در تکنیک NGS باعث شده حساسیت تشخصی جهش‌ها نسبت به سایر روش‌های امروزه که بیشتر از روش غربالگری مثل SSCP استفاده میشود، بسیار بیشتر باشد. اختلالات تک ژنی زیادی به واسطۀ NGS شناسایی شده اند. به عنوان مثال میتوان به انواع ناشنوایی‌ها، بیماری های ارثی پوست، نابینایی، بیماری های قلبی و عروقی و ... اشاره کرد.
کاربرد NGS در تشخیص ژنتیکی پیش از لانه گزینی
برای تشخیص ژنتیکی پیش از لانه گزینی (PGD) از روش های مختلفی استفاده میشود :
- تکنیک FISH که برای تشخیش آنیوپلوئیدی‌های (یک یا چند کروموزوم بیشتر یا کمتر) شناخته شده در اوایل دوران جنینی کاربرد دارد.
- تکنیک CGH که تشخیص در آن به شکل مقایسه میان DNA طبیعی و DNA جنین می‌باشد.
- آرایه‌های CGH نیز برای تشخیص عدم تعادل کروموزومی توسعه یافته اند.
- غربالگری کروموزومی جامع که با کمک PCR جهت تشخیص دقیق‌تر آنیوپلوئیدی‌ها انجام می‌گردد.
کاربرد NGS در تشخیص و درمان سرطان‌ها
تکنیک NGS قادر است همزمان اطلاعات تغییرات تعداد کپی‌ها، همجوشی و جهش‌های متوالی ژن‌ها را در هر نقطه از ژنوم که مرتبط با پیشرفت بدخیمی است، ارائه دهد. سرطان بیماری بسیار هتروژنی است و سلول‌های مختلفی را در یک تومور میتوان دید. امکان دارد جهش اصلی که سبب بدخیمی بوده تنها میان بخش کوچکی از ژنوم سلول مشاهده شود، از این رو تشخیص آن نیاز به تمرکز و دقت بالایی دارد که روش های قدیمی‌تر قادر به چنین دقتی در تشخیص نیستند. تکنیک NGS می‌تواند تغییرات ژنتیکی مربوط به سرطان را که در کسر کوچکی از سلول های آزمایش شده رخ می دهند را با دقت بسیار بالایی اندازه گیری کند. این دقت بالا به خاطر تعیین توالی میلیون‌ها قطعه DNA متفاوت از هر نمونه می‌باشد که امکان تشخیص دقیق توالی نادر را محقق می‌سازد.
کاربرد NGS در فارماکوژنومیک
یکی از عوامل اصلی مرگ و میر در بیماری‌ها و سرطان‌ها، واکنش های دارویی ناخواسته است. هرچند که عوامل زیادی در این امر موثر می‌باشد اما تنوع ژنتیکی نقش بسیار کلیدی در واکنش نامطلوب به داروها و یا قدرت تاثیر دارو بر روی بیماری و درمان آن دارد. تعیین توالی با استفاده از تکنیک NGS، شناسایی انواع مارکرهای ژنتیکی مربوط به پاسخ به دارو را تنها در یک تست ممکن می‌سازد و این امر مسبب درمان صحیح با استفاده از دارو میشود. این روش مخصوصاً در افراد با بیماری های مزمن که می‌بایست چندین دارو را همزمان باهم مصرف کنند بسیار حائز اهمیت می‌باشد.
کاربرد NGS در اپی ژنتیک
مشخص شده است که تغییرات اپی ژنتیک ارتباط مستقیمی با پیشرفت بعضی سرطان ها و اختلالات مادرزادی مانند سندرم راسل سیلور (Russel silver syndrome)، سندرم بک ویت ویدمن (Beckwith Wiedemann Syndrome) و سندرم سودوهیپوپاراتیروئیدیسم (به سندم مارتین آلبرایت نیز معروف است) دارد. سنجش های بالینی معمول قادرند تغییرات اپی ژنتیک را در ژن‌ها را نشان دهند، اما تکنیک NGS سنجش گسترده ای از تغییرات اپی ژنتیک که به عنوان علل‌های بیماری خاص شناخته می‌شوند را امکان پذیر کرده است. به عنوان مثال، تعیین توالی بیسولفيت با استفاده از روش NGS برای بررسی الگوهای متیلاسیون در سراسر ژنوم برای سرطان خون انجام گرفته است.
جمع‌بندی
گذشته از کاربردهای بسیار NGS می توان به ویژگی های بارز آن از جمله پوشش دهی بالا، احتیاج به میزان کمی از نمونه ژنومی (حدود 50 نانوگرم)، مقیاس‌پذیری بالا، توالییابی تک مرحله‌ای، کمی سازی خاصیت RNA با کیفیت زیاد، پروتکل های آماده سازی نمونه سريع و مستقیم و همچنین کاهش هزینه‌ها و زمان اشاره کرد. علیرغم همگی این مزایا این تکنیک چالش هایی را در پیش روی خود دارد که میتوان به موارد زیر اشاره کرد :
تجزیه و تحليل داده ها در سطح آزمایش‌های تحقیقاتی قابل انجام است ولی در سطح بالینی نیاز به افزایش سرعت استفاده از این داده ها در برنامه های کاربردی بالینی می‌باشد. چالش دیگر در تکنیک NGS، زیرساخت های محاسباتی هستند که مقدار اولیه این داده‌ها از ظرفیت محاسباتی سیستم‌ها فراتر رفته است. مسائل حقوقی و اخلاقی از دیگر چالش های این روش بوده، پیامدهای به اشتراک گذاری اطلاعات ژنتیکی افراد با شرکت های بیمه‌ای و کارفرمایان ممکن است منجر به تبعیض مبتنی بر اطلاعات ژنتیکی افراد شود که این مورد به خودی خود می تواند پیامدهای قانونی بسیار زیادی را در پی داشته باشد.
